角膜炎，也被稱為角膜潰瘍，是一種常見(jiàn)的角膜疾病，由細(xì)菌、真菌、病毒或變形蟲(chóng)引起。這種眼部疾病是導(dǎo)致視力喪失的主要原因，據(jù)報(bào)道，傳染性角膜炎已成為第五大致盲原因。長(zhǎng)期佩戴隱形眼鏡是導(dǎo)致了金黃色葡萄菌的侵入的主要誘因之一，這種細(xì)菌的侵入容易誘發(fā)細(xì)菌性角膜炎，其臨床癥狀為急性疼痛、紅腫、畏光。研究發(fā)現(xiàn)細(xì)菌感染可誘導(dǎo)感染組織微環(huán)境發(fā)生酸性變化，進(jìn)一步加劇疾病發(fā)病機(jī)制。傳統(tǒng)上，細(xì)菌性角膜炎最常見(jiàn)的治療方法是在眼表面局部使用廣譜抗生素滴眼液來(lái)對(duì)抗傳染性細(xì)菌。然而，由于角膜上皮屏障阻止親水藥物大分子穿透角膜，以及淚膜稀釋清除藥物溶液，大大降低了生物利用度和減少了藥物滯留時(shí)間。因此，為了維持角膜內(nèi)有足夠的藥物濃度，通常需要使用大量抗生素和頻繁給藥，這很可能給眼組織帶來(lái)毒性影響，增加抗菌素耐藥性的風(fēng)險(xiǎn)。

基于此，武漢大學(xué)藥學(xué)院黎威教授團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)了一種自植入的核殼結(jié)構(gòu)微針貼片，用于治療細(xì)菌性角膜炎。相關(guān)研究成果以“Self-Implantable Core–Shell Microneedle Patch for Long-Acting Treatment of Keratitis via Programmed Drug Release"為題發(fā)表在期刊《Small》上。武漢大學(xué)藥學(xué)院博士研究生江雪為第一作者，武漢大學(xué)藥學(xué)院黎威教授為通訊作者。

該微針貼片是利用摩方精密microArch® S240（精度：10μm）3D打印設(shè)備加工模具后經(jīng)PDMS翻模制備而成。該研究首先通過(guò)原位的還原法制備了裝載納米銀的沸石咪唑酯框架-8納米粒（Ag@ZIF-8），然后將其裝載在聚乙烯醇（PVA）組成的微針?biāo)苄院诵牟糠?。MNs的外殼結(jié)構(gòu)由生物相容性和可生物降解的天然蛋白質(zhì)絲素蛋白(SF)組成，作為抗血管生成/抗炎藥物雷帕霉素的(Rapamycin, Rapa)的緩釋藥物庫(kù)（圖1）。

圖1 裝載Ag@ZIF-8和雷帕霉素的核殼微針的示意圖

隨后通過(guò)透射電鏡，x射線光電子能譜儀等多種表征證明，當(dāng)納米銀被成功包覆在ZIF-8中，仍然可以維持ZIF-8原來(lái)的晶體結(jié)構(gòu)。氮?dú)馕椒ê蜔嶂胤治鲎C實(shí)納米銀的負(fù)載率約為15%。在不同PH下做釋放發(fā)現(xiàn)，Zn2+和Ag+在酸性pH下大量釋放，呈現(xiàn)較靈敏的酸響應(yīng)。并且通過(guò)透射電鏡觀察得到ZIF-8的結(jié)構(gòu)在酸性條件下幾乎都破壞了（圖2）。

圖2. Ag@ZIF-8 NPs的表征。A) a) ZIF-8 NPs和b) Ag@ZIF-8 NPs在水溶液中的照片。比例尺，1厘米。TEM照片c) ZIF-8 NPs和d) Ag@ZIF-8 NPs在甲醇中的分布。比例尺為100納米。B) Ag@ZIF-8 NPs的XPS測(cè)量譜。C) ZIF-8 NPs和Ag@ZIF-8 NPs的粒度分布。D) ZIF-8 NPs和Ag@ZIF-8 NPs的紫外光譜。E) ZIF-8 NPs和Ag@ZIF-8的XRD譜圖。F) ZIF-8 NPs和Ag@ZIF-8 NPs的N2吸附-解吸等溫線。G) ZIF-8 NPs和Ag@ZIF-8 NPs的TGA曲線。H) Ag@ZIF-8 NPs中Zn2+和Ag+在不同pH值介質(zhì)中的釋放分布。每個(gè)點(diǎn)代表平均值±SD (n = 3)。I)Ag@ZIF-8在不同pH值的培養(yǎng)基中孵育12小時(shí)后的TEM照片。比例尺為200 nm。

然后，通過(guò)SEM觀察微針的結(jié)構(gòu)。該微針為4×4的方形矩陣，針體呈圓錐形，底部直徑為400 μm，高度為850 μm。殼層絲素蛋白用羅丹明標(biāo)記，核層用FITC標(biāo)記，在共聚焦顯微鏡下可明顯觀察到紅色熒光包裹綠色熒光。同時(shí)通過(guò)元素映射分析針尖的橫截面，可以觀察到殼層擁有豐富的氮元素，而殼層包圍的核心層富集較多的Zn元素，證實(shí)了微針的殼核結(jié)構(gòu)。通過(guò)穿刺明膠凝膠塊，可以觀察到FITC標(biāo)記的PVA層進(jìn)入凝膠后立即向上擴(kuò)散，而紅色標(biāo)記的SF層保持不變（圖3）。

圖3. 核殼MN貼片的表征。A)制備的核殼MN貼片、單個(gè)MN、針尖和針底的SEM圖像。比例尺從左到右分別代表400 μm、400 μm、20 μm、20 μm。B)用不同熒光標(biāo)記核-殼MN的亮場(chǎng)和熒光圖像，殼標(biāo)記為紅色，核標(biāo)記為綠色。比例尺，500 μm。C)核殼MN在不同深度的橫截面圖。標(biāo)尺，50 μm。D)核-殼MN的EDS元素映射分析。標(biāo)尺，20 μm。E)明膠水凝膠中核殼MNs的快速分離。比例尺，500 μm。黃色箭頭表示綠色熒光標(biāo)記的NPs從MNs核心快速釋放，藍(lán)色虛線表示空氣和水凝膠之間的界面。

緊接著，通過(guò)力學(xué)測(cè)試和體外眼球上穿刺，證實(shí)了該殼核微針具有較好的力學(xué)性能和較高的穿刺效率。核心層進(jìn)入眼球后，立即擴(kuò)散，而殼層保持不變。微針的藥物釋放曲線同樣證實(shí)了核心層的速釋和殼層的緩釋（圖4）。這種殼層結(jié)構(gòu)可以用來(lái)保護(hù)核心層，使抗菌納米粒較多的遞送到角膜基質(zhì)，而不是溶解在角膜表層。

圖4. 體外和離體核殼MN貼片角膜植入和藥物釋放動(dòng)力學(xué)。A)核殼MNs的力學(xué)試驗(yàn)。B)核殼MNs貼片在離體大鼠角膜上的應(yīng)用。比例尺，500 μm。C) ZIF-8 NPs和D) Rapa的體外釋放行為。E)離體角膜植入前后核殼MN貼片的亮場(chǎng)圖像。比例尺，500 μm。

最后通過(guò)在角膜基質(zhì)內(nèi)注射金黃色葡萄球菌，實(shí)現(xiàn)在大鼠上造細(xì)菌性角膜炎模型，然后通過(guò)鏡下觀察眼球，提取角膜細(xì)菌，角膜炎臨床評(píng)分和病理切片來(lái)評(píng)估殼核微針的治療效果（圖5）。相比于其他組，殼核微針不僅在較短時(shí)間（5天）內(nèi)殺死了細(xì)菌，抑制了角膜炎癥，并且減少了角膜新生血管的發(fā)生，這得益于殼核微針較高的遞藥效率和雷帕霉素的長(zhǎng)效緩釋能力。我們還發(fā)現(xiàn)空白MNs在老鼠觀察期間沒(méi)有造成任何損傷，也沒(méi)有加重角膜炎的發(fā)展，證明了MNs的安全性。

圖5. 核殼MNs貼片治療細(xì)菌性角膜炎的療效觀察。A)處理過(guò)程示意圖。B)角膜炎大鼠經(jīng)Ag@ZIF-8滴劑、Ag@ZIF-8與Rapa滴劑混合、空白MNs、Ag@ZIF-8治療后的眼球照片原子核-殼層原子。以健康大鼠眼為陽(yáng)性對(duì)照，未處理的模型大鼠眼為陽(yáng)性對(duì)照。綠色箭頭表示角膜中生成的血管。比例尺，2mm(上)和400 μm(下)。C)第5天各組大鼠角膜提取的細(xì)菌涂板。比例尺，2.5厘米。D)各組細(xì)菌菌落的定量。E)臨床各組大鼠的角膜炎得分。F)各組大鼠角膜H&E染色。標(biāo)尺, 200 μm。

結(jié)論：在這項(xiàng)工作中，我們?cè)O(shè)計(jì)了一種具有核-殼結(jié)構(gòu)的眼部微針貼片，用于協(xié)同治療細(xì)菌性角膜炎。這種微針貼片含有pH響應(yīng)性Ag@ZIF-8 NPs和抗炎抗血管生成的藥物(即Rapa)。在角膜植入后，由于淚液快速溶解可溶層，核殼MNs可以迅速?gòu)馁N片背襯中分離并嵌入角膜。MNs植入后，Ag@ZIF-8 NPs從核心層擴(kuò)散，隨后在感染角膜的酸性環(huán)境中發(fā)生響應(yīng)性降解，通過(guò)釋放金屬離子(Zn2+、Ag+)發(fā)揮抗菌活性，促進(jìn)角膜上皮細(xì)胞遷移。同時(shí)，由天然材料(即SF)組成的可降解外殼使Rapa緩慢釋放，從而實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)效抗炎和抗角膜血管生成。由于有益的程序性藥物釋放特性，單次給藥核殼微針貼片在細(xì)菌性角膜炎大鼠模型中實(shí)現(xiàn)了*的協(xié)同抗菌、血管抑制和抗炎效果，為細(xì)菌性角膜炎的治療提供了一種有前景的方法。