技術(shù)文章
Technical articles骨仿生學(xué)和結(jié)構(gòu)工程激發(fā)了人們對(duì)優(yōu)化人工支架以實(shí)現(xiàn)更好的骨再生的廣泛興趣。然而,支架孔隙形態(tài)調(diào)節(jié)骨再生背后的機(jī)制尚不清楚,這使得用于骨修復(fù)的支架結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)具有挑戰(zhàn)性。為了解決這個(gè)問題,來自華南理工大學(xué)的況宇迪、趙娜如、王迎軍等人仔細(xì)評(píng)估了三種代表性孔隙形態(tài)(即圓柱形(C)、螺旋形(G)和菱形(D))β-TCP支架的成骨性能(圖1a)。結(jié)果表明 D 型支架通過增強(qiáng) RhoA/ROCK2 通路的機(jī)械信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)促進(jìn) BM
SC 向成骨分化并分泌更多與遷移相關(guān)的生長(zhǎng)因子,從而在這些支架中實(shí)現(xiàn)最佳骨再生(圖1b)。這項(xiàng)工作為開發(fā)新型生物適應(yīng)性支架設(shè)計(jì)提供了對(duì)孔隙形態(tài)介導(dǎo)的骨再生機(jī)制的見解。相關(guān)研究成果以“3D printed pore morphology mediates bone marrow stem cell behaviors via RhoA/ROCK2 signaling pathway for accelerating bone regeneration"為題于2023年3月20日發(fā)表在《Bioact. Mater.》上。
圖1 不同孔隙形態(tài)的支架方案及支架-BMSC相互作用機(jī)制:(A)具有圓柱形、螺旋形和菱形孔形態(tài)的 3D 打印支架;(B)孔隙形態(tài)介導(dǎo)的細(xì)胞骨架力和 BMSCs 的核變形通過 RhoA/ROCK2 信號(hào)通路促進(jìn)骨再生
1. 不同孔形態(tài)的β-TCP支架上的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞行為
成功制備了三種孔結(jié)構(gòu)的β-TCP支架(圖2a),BMSCs在支架上表現(xiàn)出不同的鋪展?fàn)顟B(tài)(圖2b)。由于細(xì)胞的不同伸展和伸長(zhǎng)狀態(tài)會(huì)影響基因的表達(dá),這些支架上的BMSCs可能會(huì)表現(xiàn)出不同的細(xì)胞行為和命運(yùn)。隨后制備了一種定制的具有整合路徑的支架(每個(gè)路徑由一種孔形態(tài)組成)評(píng)估BMSCs從支架外到支架內(nèi)部的遷移行為,如圖2C所示。遷移實(shí)驗(yàn)表明,D-和G-支架具有更好的引導(dǎo)骨再生的潛力(圖2D,E)。CCK8檢測(cè)結(jié)果顯示,BMSCs在C-支架上的增殖情況明顯好于其他各組(圖2F),這可能歸因于類多邊形展開態(tài)引起的內(nèi)應(yīng)力的松弛堿性磷酸酶(ALP)活性(圖2G)和RT-qPCR(圖2H)結(jié)果顯示,第7天,D支架組ALP、Col-1、OCN和Runx2的表達(dá)最高,C支架組最。低。上述結(jié)果證實(shí)了D-支架在這些支架中誘導(dǎo)BMSCs成骨分化效。果。最。好。此外,研究了孔形態(tài)對(duì)BMSCs血管生成因子旁分泌的影響(圖2I))。成血管測(cè)試表明G-支架組BMSC培養(yǎng)上清液中VEGF和Ang-1的濃度最高(圖2J),具有更好的骨再生效果(圖2K,L)。
圖2 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在不同β-tCP支架上的細(xì)胞行為
2. 孔形態(tài)介導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞行為的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制
RNA測(cè)序結(jié)果顯示,與C組相比,D組和G組的一些基因表達(dá)上調(diào)(圖3A),表明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在D-支架中的遷移能力最。強(qiáng)。此外,與C-支架組相比,G-和D-支架組中成骨分化相關(guān)基因(例如OCN3、BMP2和ALPK1)和血管生成相關(guān)因子(例如VEGFA、PDGFC和PDGFA)也上調(diào)(圖3B,C)。聚類分析和熱圖的樹狀圖顯示,RhoA/ROCK2信號(hào)通路相關(guān)基因(DVL2、DAAM1、RhoA和ROCK2)在G-和D-支架組的表達(dá)高于C-支架組(圖3D)。RT-qPCR分析和Western blotting也證實(shí)了RhoA/ROCK2信號(hào)通路相關(guān)基因和蛋白在G-支架和D-支架中的高表達(dá)(圖3E-L)。這些結(jié)果揭示了BMSCs在不同孔形態(tài)的支架中進(jìn)行不同的細(xì)胞骨架重組和機(jī)械應(yīng)力傳遞。
圖3 RNA測(cè)序和生物信息學(xué)分析
隨后,檢測(cè)了在不同支架上培養(yǎng)的BMSCs在含有和不含RhoA/ROCK2抑制劑的培養(yǎng)液中的成骨分化和遷移因子水平。當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)液中沒有RhoA/ROCK2抑制劑時(shí),G-和D-支架組比C-支架組RhoA、ROCK2和激活蛋白(p-RhoA、p-ROCK2)水平更高(圖4A-D)。CDC42、OCN和Runx2的蛋白表達(dá)水平順序?yàn)镈-支架>G-支架>C-支架。這些結(jié)果表明,RhoA/ROCK2信號(hào)通路在轉(zhuǎn)導(dǎo)支架孔形態(tài)刺激調(diào)控BMSCs成骨分化和遷移中發(fā)揮了重要作用。圖4E是支架孔形態(tài)介導(dǎo)的BMSC行為機(jī)理圖,孔形態(tài)通過RhoA/ROCK2信號(hào)通路影響B(tài)MSCs成骨分化和遷移。
圖4 (A-C)藥物對(duì)RhoA/ROCK2信號(hào)通路的干預(yù);(D)用ELISA法檢測(cè)在RhoA和RoCK2抑制劑干預(yù)前后7天不同孔隙形態(tài)的成骨相關(guān)Runx2和遷移相關(guān)CDC42蛋白的水平;(E)機(jī)制綜述:孔形態(tài)通過RhoA/ROCK2信號(hào)通路影響B(tài)MSCs成骨分化和遷移
3. 不同孔形態(tài)支架體內(nèi)骨再生的評(píng)價(jià)
隨后,構(gòu)建股骨髁缺損評(píng)價(jià)支架體內(nèi)骨再生效果(圖5A)。骨小梁計(jì)數(shù)、Micro-CT、血管分布檢測(cè)、Van Gieson染色(VG)結(jié)果均顯示G-和D-支架的血管生成能力強(qiáng)于C-支架,可以促進(jìn)骨再生。
圖5 股骨髁缺損區(qū)術(shù)后4周、8周、12周植入支架的組織學(xué)分析及Micro-CT檢查
此外,通過連續(xù)熒光標(biāo)記檢測(cè)所有支架在2-4周和6-8周的動(dòng)態(tài)成骨來評(píng)估骨再生率(圖6)。柱狀缺損區(qū)被分為三個(gè)部分(外層:0-1 mm,中層:1-2 mm,內(nèi)層:2-3 mm),以更好地定量缺損區(qū)不同區(qū)域的新骨生長(zhǎng)(圖6a)。熒光標(biāo)記染色結(jié)果顯示,C-支架組支架的新骨沉積速度從外到中逐漸減慢,C-支架中心區(qū)域幾乎沒有新骨(圖6B,C)。相比之下,D和G支架的中層和中心層的骨沉積速率明顯較高,表明細(xì)胞在支架中的遷移速率不同。這些結(jié)果揭示了支架形態(tài)對(duì)體內(nèi)新骨生長(zhǎng)的重要指導(dǎo)作用。
圖6 成骨的動(dòng)態(tài)組織學(xué)分析
綜上所述,本文在體外和體內(nèi)評(píng)估了三種孔結(jié)構(gòu)的β-TcP支架的成骨潛力。D-支架通過影響B(tài)MSCs的黏附狀態(tài),激活較高水平的RhoA/ROCK2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,促進(jìn)細(xì)胞遷移,促進(jìn)BMSCs的成骨分化。同時(shí),D-支架和G-支架還可通過影響骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的旁分泌來促進(jìn)血管生成。在體內(nèi)骨修復(fù)的評(píng)價(jià)中,D-支架在促進(jìn)骨修復(fù)方面的表現(xiàn)優(yōu)于G-支架和C-支架。這項(xiàng)工作加深了我們對(duì)孔形態(tài)影響細(xì)胞行為的機(jī)制的理解。